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  • 粗多糖的測(cè)定方法

    發(fā)布于 2011/09/21閱讀(2066)來源 zxj標(biāo)簽 粗多糖檢測(cè)

    摘要

    粗多糖的測(cè)定方法

    內(nèi)容

    粗多糖的測(cè)定方法
    1. 原理
    分子量大于10,000道爾頓的多糖經(jīng)80%乙醇沉淀后,加入堿性銅試劑,選擇性地從其他高分子物質(zhì)中沉淀出葡聚糖,沉淀部分與苯酚-H2SO4反應(yīng),生成有色物質(zhì),在485nm條件下,有色物質(zhì)的吸光度值與葡聚糖濃度成正比。
    2. 適用范圍
    參照AOAC方法。適用于檢測(cè)含有分子量大于10,000道爾頓葡聚糖的樣品。
    3.儀器
    (1) 分光光度計(jì)
    (2) 離心機(jī)
    (3) 旋轉(zhuǎn)混勻器
    (4) 恒溫水浴鍋
    4.試劑
    除特殊說明外,實(shí)驗(yàn)用水為蒸餾水,試劑為分析純。
    (1) 80%乙醇:800ml無水乙醇加水200ml。
    (2) 2.5 mol/L NaOH溶液:100 g NaOH加蒸餾水稀釋至1 L,加入固體無水硫酸鈉至飽和。
    (3) 銅貯存液:稱取3.0 g CuSO4 ·5H2O,30.0 g檸檬酸鈉加水溶解至1 L。溶液可貯存2周。
    (4) 銅應(yīng)用溶液:取銅貯存液50 ml,加水50 ml混勻后加入無水硫酸鈉12.5 g,臨用新配。
    (5) 洗滌液:取水50 ml,加入10 ml銅應(yīng)用溶液,10 ml 2.5 mol/L NaOH溶液,混勻。
    (6) 1.8 mol/L H2SO4:取100ml濃硫酸用水稀釋至1L。
    (7) 20 g/L苯酚溶液:稱取2.0g苯酚,加水溶解并稀釋至100ml,混勻備用。
    (8)葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)液:稱取500mg葡聚糖(分子量500,000D)于稱量皿中,105℃干燥4h至恒重,置于裝有干燥硅膠的干燥器中冷卻。準(zhǔn)確稱取100mg干燥后的葡聚糖,用水定容至100ml,葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)濃度為1.0mg/ml。
    (9) 葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液:吸取葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)液10ml,用水稀釋10倍,葡聚糖終濃度為0.1mg/ml。
    5. 操作方法
    5.1 樣品處理
    (1) 樣品提?。悍Q取樣品1~5g,加水100ml,沸水浴加熱2h,冷卻至室溫,定容至200ml(V1),混勻后過濾,棄初濾液,收集余下濾液。
    (2) 沉淀高分子物質(zhì):準(zhǔn)確吸取上述濾液100ml(V2),置于燒杯中,加熱濃縮至10ml,冷卻后,加入無水乙醇40ml,將溶液轉(zhuǎn)至離心管中以3000rpm離心5min,棄上清液,殘?jiān)?0%乙醇洗滌3次,殘?jiān)┏恋砥暇厶侵谩?br /> (3) 沉淀葡聚糖:上述殘?jiān)盟芙猓⒍ㄈ葜?0ml (V3),混勻后過濾,棄初始濾液后,取濾液2.0ml(V4),加入2.5mol/L NaOH2.0ml,Cu應(yīng)用溶液2.0ml,沸水浴中煮沸2mim,冷卻后以3000rpm離心5min,棄上清液,殘?jiān)孟礈煲合礈?次,殘?jiān)y(cè)定葡聚糖之用。
    (4) 測(cè)定葡聚糖:上述殘?jiān)?.0mL 1.8mol/LH2SO4溶解,用水定容至100mL(V5)。準(zhǔn)確吸取2.0ml(V6),置于25ml比色管中,加入1.0ml苯酚溶液,10ml濃硫酸,沸水浴煮沸2分鐘,冷卻比色。從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得相應(yīng)含量,計(jì)算粗多糖含量。
    5.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備:
    精密吸取葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液0.10,0.20,0.40,0.60,0.80,1.00,1.50,2.00ml(分別相當(dāng)于葡聚糖0.01,0.02,0.04,0.06,0.08,0.10,0.15,0.20mg),補(bǔ)充水至2.0mL,加入苯酚溶液1.0ml,濃硫酸10ml,混勻,沸水浴2分鐘,混勻,沸水浴2分鐘,冷卻后用分光光度計(jì)在485nm波長(zhǎng)處以試劑空白溶液為參比,測(cè)定吸光度值(A),以葡聚糖濃度為橫坐標(biāo),A為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
    6.計(jì)算
    從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得樣品相應(yīng)含量,計(jì)算粗多糖含量。 葡聚糖( % ) =
     c× V5×V3×V1×0.1
     =
     c× 250
     ………………………(1 )
     
    V6×V4×V2×m
     m
     

    公式中:c--從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得樣品測(cè)定管中葡聚糖含量,mg;
    V1--樣品提取時(shí)定容體積,ml;
    V2--沉淀高分子物質(zhì)取液量,ml;
    V3 --沉淀葡聚糖時(shí)定容量,ml;
    V4 --沉淀葡聚糖時(shí)取液量,ml;
    V5 --測(cè)定葡聚糖時(shí)定容體積,ml;
    V6 --樣品比色管中取樣液體積,ml;
    m--樣品稱量質(zhì)量,g;
    0.1--將mg/g 換算成g/100g 的系數(shù)。
    7.注意事項(xiàng)
    (1) 苯酚-H2SO4溶液可以和多種糖類進(jìn)行顯色反應(yīng),常用于總糖的測(cè)定。所以測(cè)定過程中應(yīng)注意容器及試劑中其他糖類的干擾。
    (2)苯酚-H2SO4溶液和不同類的糖反應(yīng),顯色的強(qiáng)度略有不同,反映在標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率不同。如果已知樣品中糖的結(jié)構(gòu),應(yīng)盡量以同類糖的純品做標(biāo)準(zhǔn)品,或以含有已知濃度的同類產(chǎn)品做對(duì)照品進(jìn)行檢測(cè)分析;如果樣品中糖的類型未知或結(jié)構(gòu)多樣,則只能以葡萄糖計(jì)或其他糖計(jì)報(bào)告結(jié)果。
    (3) 試驗(yàn)證明葡萄糖、果糖等單糖,蔗糖、乳糖等雙糖、低聚糖--棉子糖,淀粉、糊精等多糖及甜味劑糖精不干擾粗多糖測(cè)定。

     

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